荧光原位杂交（FISH）可用于检测细胞内特定的DNA或RNA，从而判断特定基因的表达及定位情况，也可用于检测肿瘤或其他疾病发生、发展过程中染色体的变化。

荧光原位杂交技术简介

FISH（Fluoresence In Situ Hybridization）技术是20世纪80年代发展起来的一种核酸定位技术，已在人类基因组研究中得到广泛应用。利用中期染色体FISH，可进行SCP、Cosmid和YAC的染色体定位以及嵌合克隆的鉴别；利用间期核FISH，可在50 kb分辨率下进行基因作图。随着研究的不断深入，目前已能够开展伸展染色质丝（chromatin fibre）FISH，直接测量基因长度，从而实现高精度基因作图。随着FISH技术的发展，其将在人类及其他物种的基因组研究中发挥更大的作用。

荧光标记的染色体原位杂交技术提供了一种快速、有效的研究手段，可将DNA片段与真核生物细胞特定的染色体区带对应起来，并实现相关DNA片段的定位分析。这是研究DNA序列在染色体上定位的直接方法之一。

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（1）直接标记法：将荧光分子直接标记于探针DNA/RNA上，杂交后可直接在荧光显微镜下进行检测。该方法快速简便，但由于杂交信号较弱且无法进一步放大，过去应用较少。不过，该方法具有背景信号低的优点，近年来已在部分公司的试剂盒中得到应用。

（2）间接标记法：常用的间接标记法是将类似于半抗原（hapten）的标记分子掺入探针分子中。常用的标记物包括生物素、地高辛（digoxigenin）、二硝基苯（dinitrophenyl，DNP）、氨基乙酰芴（aminoacetylfluorene，AAF）、汞及磺酸盐（sulfonate）等。就掺入方式来说，生物素、地高辛等通常以核苷酸衍生物的形式掺入，可采用切口平移法进行标记。现在更多的人开始用随机引物法。用这两种方法标记好的探针大小在200一500bp范围内，是用于杂交的最佳大小。此外，也可在已知序列的两个引物之间采用PCR法进行扩增，或通过合适载体的RNA转录获得探针。

1、原理

FISH技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。其基本原理是：利用已知核酸序列制备探针，并采用荧光素直接标记或非放射性物质间接标记的方法，使探针与靶DNA进行杂交；随后通过免疫细胞化学方法连接荧光标记物，最后在荧光显微镜下观察杂交信号，从而对标本中的待测核酸进行定性、定量及定位分析。

2、实验流程

FISH技术的基本流程包括：样本制备→探针制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。

3、特点

原位杂交探针按标记分子类型可分为放射性标记探针和非放射性标记探针。采用同位素标记的放射性探针，其优点在于对样品制备要求较低，并且可通过延长曝光时间增强信号强度，因此灵敏度较高。但其缺点包括：探针稳定性较差、自显影时间较长、放射线散射导致空间分辨率较低，以及同位素操作过程较为繁琐等。

采用荧光标记系统则可克服上述不足，这就是FISH技术。作为一种非放射性检测体系，FISH技术具有以下优点：

首先，从探针制备和杂交过程来看，生物素及其他标记分子均不具有放射性，因此标记和杂交过程中不存在放射性污染风险，安全性较高。同时，经生物素或其他标记分子标记后的探针稳定性较好，不受半衰期限制，可长期保存。此外，荧光显色时间较短，不像同位素杂交那样需要长时间曝光，且背景信号低、结果清晰，其灵敏度也较高。

另外，FISH技术还可实现多种颜色的同时显色，这是同位素杂交难以实现的。多色作图不仅可以使染色体分带和探针信号呈现不同颜色并同时观察，还可利用不同荧光分别标记不同探针，以确定各探针在染色体上的相对位置。

缺点：FISH技术的杂交效率无法达到100%，尤其是在使用较短的cDNA探针时，杂交效率会明显下降。

4、应用

FISH技术不仅可用于已知基因或核酸序列的染色体定位，也可用于未克隆基因、遗传标记以及染色体畸变的研究，在基因定性、定量、定位、整合及表达研究等方面具有重要应用价值。

I．染色体结构变异与非整倍体的检测：荧光原位杂交简化了染色体结构变异的检测。利用原位杂交可比较容易地检测出缺失、 附加或替换的染色体。

II．基因扩增与和缺失检测：FISH技术具有较高的空间分辨率和灵敏度，使亲本基因和扩增基因在细胞中的定位分析成为可能。同时，FISH技术还可用于定位转基因植物中外源基因的位置及其拷贝数，该方法已在番茄、烟草、大麦、小麦和黑麦等作物研究中获得成功。此外，FISH技术还可用于检测与遗传性疾病相关的基因缺失。例如，研究人员已利用该技术成功检测出无虹膜症（aniridia，一种罕见的遗传性虹膜发育异常疾。┗颊咧械南喙鼗蛉笔。

III．着丝粒与端粒研究：FISH 技术为着丝粒结构研究提供了重要手段。同时应用 FISH 技术可直接观察染色体端粒，从而简化染色体核内结构及其功能的研究。

IV．基因作图：利用FISH技术可直接检测DNA在染色体上的位置，所获得的定位结果反映的是基因在染色体上的实际物理位置。由于原位杂交不受位点内变异及位点间拷贝数差异的影响，FISH技术已成为重复序列和多基因家族基因作图的重要工具。

V．染色体RNA和基因组进化研究：染色体的主要成分包括DNA和组蛋白，除此之外，还含有非组蛋白及RNA。对这些成分在染色体中的分布进行精确定位，是研究染色体高级结构及构建染色体模型的重要基础。FISH技术为上述研究提供了有效手段，并在染色体RNA分布及基因组进化研究中发挥重要作用。

荧光原位杂交技术主要应用于以下领域：

随着标记技术、检测试剂及荧光成像技术的不断发展，染色体FISH的应用范围持续拓展。特别是激光共聚焦显微技术的发展，使核结构的三维重建能够在计算机辅助下实现。染色体FISH不仅可用于基因定位，还可用于研究基因在细胞核内的空间分布及其功能关系。

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