染色体原位分子杂交技术

染色体原位分子杂交技术（Chromosome Analysis by Fluorescence in situ Hybridization，FISH）的发展为研究染色体DNA序列提供了直观而有效的方法。该技术具有经济、安全、操作快速、稳定性好及灵敏度高等优点。多色FISH可在同一细胞核内同时显示两种或多种序列，并可用于间期细胞核染色体的研究。通过使用不同类型的探针，可显示某一物种的全部基因组、特定染色体片段以及单拷贝序列。结合共聚焦激光显微镜，还可对间期细胞核及染色体进行三维结构分析，从而实现杂交信号的精确检测与定位。

二、探针（probes）

1．基因组探针（Genomic probe）：

人类基因组中含有大量高频重复序列，其进化保守性较低。当以基因组DNA作为探针时，探针与靶细胞序列中高度重复序列会优先退火结合，从而避开保守的单拷贝序列，因此杂交呈现明显的种属特异性。利用该类探针在人—鼠杂交细胞中可特异性显示人类遗传物质。

2．染色体特异性序列探针（Probe recognizing chromosome specific sequences)：

目前在人类几乎所有染色体中均已克隆到特异性重复序列，其重复次数约为100～5000次，多位于着丝粒区或异染色质区，形成致密的杂交带，可用于特异识别某一条染色体

3．染色体文库探针（chromosome labraries probe）：

染色体文库收集人类单条染色体的DNA作为探针，又称整体染色体探针或染色体染探针。单条染色体的获得一般有两种方法：来自仅携有某一条人类染色体的体细胞杂交株，或经流式细胞分类仪从染色体悬液中分离

4．单一序列探针（single-copy sequences probe）：

FISH有一弱点，就是要求探针足够大，探针越小，杂交位点检出率就越低。欲利用FISH检测存在基因组内的单一序列基因，最有效的方法是应用含大插入片段的克隆载体，如全Cosmids（载约40kb的插入片段），更大的YAC载体（载100-800kb插入片段）。若掌握好，小到2kb的质粒探针亦可用FISH方法定位，但效率较低。

三、FISH技术系列

1．24色 mFISH核型分析技术

24色mFISH是近年建立的核型分析技术。其原理是使用5种荧光染料按比例标记探针，杂交后形成24条染色体各自呈现特异的荧光色彩以供核型分析。为研究人员提供了更丰富详尽的细胞遗传学信息，包括确定标记染色体的来源、检测微小的染色体易位和检测复杂的染色体易位，尤其为肿瘤细胞染色体分析提供了全新、高效的方法。

2．原位杂交显带技术(In situ hybridization banding,ISHB)

为了准确定位原位杂交部位所处染色体及其区带，染色体必须显带。但无论是先杂交后显带，还是显带后杂交，杂交与显带过程回互相影响效果。后来人们注意到，人类短间隔插入重复序列中的一种Alu家族，Alu片段约300bp长，在基因组中重复约九十万次，平均间隔3-4kb就插入一个。有人利用部分Alu序列作为引物，用PCR方法扩增Alu之间的DNA，称Alu-PCR法。但Alu序列在基因组内分布不是随机的，有些区域比较密集，有些区域较稀疏。只有前者才有PCR产物。人们用Alu-PCR产物作为探针与人类染色体标本杂交，结果得到类似R带的荧光带型。故人们在进行基因定位时，只需将目的探针与Alu-PCR探针同时应用，用不同颜色的荧光标记，就可同时显示杂交信号和染色体带型。

3．FISH基因定位（FISH mapping）

基因定位时，不但需要确定某段靶序列在染色体上的位置，尚需确定两个或两个以上靶序列在线性DNA分子的排列次序和距离，才能绘出基因图。一般用同位素杂交：先确定每一靶序列在中期染色体上的位置，然后根据它们到端粒的距离确定出线形排列次序。而用FISH方法，两种或两种以上的探针能同时与中期染色体杂交，只要根据两种颜色杂交位点的相互位置，就能直接确定次序。但中期染色体是线形DNA分子经过折叠和包装后形成的，若两个靶序列相距很近，例如间距小于1Mbp，受包装过程的影响，它们在线形DNA分子上的排列与在中期染色体上的排列不一定相同，甚至可能完全相反。学者们发现，靶序列之间在间期核的平均相对距离与它们在线形DNA分子上的距离呈正相关。利用间期核FISH分析不但能排除染色体包装的影响，还能提高测距的分辨率。

四、FISH的应用

1．基因定位与基因制图（Gene mapping）

原理前面已叙述。FISH已经极大地加速了人类基因定位和基因制图的进程。

2．基因诊断(Gene diagnosis)

精确、直观、明了

3．间期细胞遗传学（Interphase cytogenetics）

4．FISH在肿瘤生物学中的应用

（1）肿瘤细胞遗传学（Onco-cytogenetics）

（2）基因定位：FISH可用于分离出的癌基因与抑癌基因初步定位

（3）病毒基因插入基因组部分的检测：

虽然逆转录病毒以激活原癌基因为主，也有象腺病毒、HPV、SV40等病毒以蛋白产物与抑癌基因蛋白产物相互作用而诱导细胞转化。但病毒基因特别是DNA病毒多有病毒基因成分插入到人基因组。利用FISH可以检测到病毒整合到人基因组中的情况，对深入研究病毒致癌机理，以及检测、防治均具有重要意义。

（4）基因的扩增与缺失

原癌基因的激活与抑癌基因的失活是目前肿瘤研究的热点。

已知原癌基因的激活方式有：突变、基因扩增、易位、病毒序列插入。

抑癌基因的激活方式有：点突变、基因缺失。

FISH为研究基因的扩增和缺失提供了新的方法，能将基因扩增和染色体重复分开。